DNA Sequencing

Secara molekuler, pengertian dari sebuah molekul DNA berasal dari penentuan sekuen nukeotida. Fungsi dari sebuah gen sering dapat ditentukan berdasarkan sekuen nukeotida, misalnya dengan cara membandingkan sekuens nukeotida dengan gen yang telah diketahui fungsinya.

Sekuen nukleotoda DNA dapat ditentukan berdasarkan metode dari Alan Maxam dan Walter Gilbert atau disebut juga penentuan sekuens berdasarkan prosedur kimia. Metode ini memerlukan label radioaktif pada satu ujung dan pemurnian fragmen DNA yang akan disekuens. Perlakuan kimia menghasilkan pemutusan pada proporsi yang kecil satu atau dua dari empat basa nukeotida pada masing-masing reaksi (G, A+G, C, C+T). Sehingga sebuah seri dari fragmen yang dilabel dihasilkan dari ujung yang diradiolabel ke situs pemutusan pertama pada tiap molekul. Fragmen pada ke-empat reaksi diatur bersebelahan pada gel elektroforesis untuk pemisahan berdasarkan ukuran. Untuk memvisualisasi fragmen, gel diekspos kepada X-ray film untuk autoradiografi. Dan menghasilkan sebuah seri band yang gelap yang masing-masing mewakili fragmen DNA yang diradiolabel.

Teknik lain yang lebih disenangi dan banyak digunakan adalah teknik penentuan sekuens yang dikembangkan oleh Fred Sanger yang disebut juga metode dideoxynucleotide.
Metode dideoxynucleotide menggunakan molekul dideoxynucleotide yang tidak memiliki gugus hidroksil pada karbon no-3 dari gula, sedangkan deoxyribonucleotide normal memiliki group 3-hydroxyl pada unit gulanya. Selama replikasi DNA, deoxynucleoside triphosphate yang datang berikatan pada 5-phosphate dengan 3-hydroxyl dari nukleotida yang sudah ada. Tetapi jika yang beikatan adalah dideoxynucleotide, maka sintesis DNA akan berhenti.

Teknik dideoxynucleotide memerlukan primer sebagai pemula reaksi sintesis untai komplementer. Reaksi sintesis untai DNA dimulai dengan penambahan polimerase Klenow dan masing-masing dari ke-4 deoksinukleotid (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Di samping itu ditambahkan pula satu nukleotide yang dimodifikasi yaitu dideoxinukleotid (misalnya dideoksi ATP). Nukeotid ini menyebabkan penghentian sintesis untai selanjutnya. Jika dideoksi ATP ditambahkan, penghentian akan terjadi pada posisi yang berlawanan dengan timidin pada DNA cetakan. Tetapi penghentian tidak selalu terjadi pada timidin pertama, karena dATP yang normal juga terdapat dan mungkin digabungkan lebih dulu daripada dideoxinukeotida. Rasio dATP terhadap dideoxinukeotida adalah sedemikian sehingga tiap-tiap untai mengalamisasi polimerisasi sampai cukup panjang sebelum dideoxy-ATP ditambahkan. Sehingga diperoleh kumpulan untai baru yang semua memiliki panjang yang berbeda tetapi masing-masing berakhir pada dideoxi-ATP.

Reaksi sintesis untai DNA dilakukan empat kali secara paralel. Terdapat juga reaksi dengan dideoxy-TTP, dideoxy-GTP dan dideoxy-CTP. Langkah selanjutnya adalah memisahkan komponen tiap-tiap kelompok yang dapat dilakukan dengan gel elektroforesis. Kondisinya harus diatur dengan baik agar dapat terjadi pemisahan dengan panjang yang berbeda hanya satu nukeotida. Elektroforesis dilakukan dengan gel poliakrilamid yang sangat tipis dan panjang. Tiap pita dalam gel akan mengandung DNA dalam jumlah kecil sehingga diperlukan autoradiografi dengan memasukkan deoksinukeotide radioaktif.

Dalam perkembangan selanjutnya, radioaktif digantingan dengan label fluorescent.label fluorescent berikatan dengan dideoxynucleotide, sehingga tiap molekul chain-terminated membawa label tunggal pada ujung 3’. Fluorochrome yang berbeda dapat digunakan untuk tiap di-deoxyNTP. Deteksi signal fluorescent dapat dilakukan dengan sistem imaging yang khusus yang menggunakan komputer untuk membaca sekuens DNA. Produk reaksi dimasukkan dalam gel poliakrilamide atau dalam tabung tunggal pada capillary electrophoresis dan di-run melalui detektor fluorescent.
Dalam sequencing dengan chain termination ini, gen yang di-sequencing dapat diklon terlebih dahulu dalam vektor M13. Primer akan berikatan dengan nukleotida pada M13. Sequencing juga dapat dilakukan tanpa kloning, tetapi langsung dari produk PCR yang dihasilkan.

Pustaka
Anonim. DNA Sequencing. http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing
Brown, TA. 2001. Gene cloning and DNA analysis: an introduction. Blackwell science Ltd, Victoria, Australia
Glick, B.R., Pasternak, J.J. 1994. Molecular Biotechnology: principles and applications of recombinant DNA. ASM Press, Washington, DC.